注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
13(18)-Oleanen-3-ol2,2'-二萘胺 98%石英砂 AR,6-10目,2-3mm

13(18)-Oleanen-3-one3-二甲基氨基-1- 99%石英砂 AR,8-16目或1-2mm

14,17-Epidioxy-28-r-15-taraxerene-2,3-diol4-甲基二苯胺 98%2-氨基吡啶 CP

15-Deoxoeucosterol3-甲基二苯胺 98%甲酯 99%

16-O-Acetylpolyporenic acid C4-甲氧基-4'-甲基二苯胺 98%氨基黑10B AR

16-Oxoalisol A4-甲氧基二苯胺 98%石杉?jí)A甲 99%

20,24-Dihydroxydammar-25-en-3-one甲基烯酸酐 94%蛻皮激素 分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥95% (HPLC)

20,24-Epoxy-24-methoxy-23(24-25)abeo-dammaran-3-one4-硝基三苯胺 98%蛻皮激素 ≥93% (HPLC), 粉末

20(29)-Lupene-3,23-diol三(4-基)胺 97%蛻皮激素 ≥95% (HPLC), 粉末

20-Hydroxy-3-oxo-28-lupaic acid三(4-苯)胺 98%芍藥苷  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

20R-Ginseside Rg2三(4-甲酰苯基)胺 97%芍藥苷  ≥98% (HPLC)

(20R)-Ginseside Rh1N,N,N,N-四苯基聯(lián)苯胺  98%仲丁 standard for GC, ≥99.8% (GC)

20(R)-Ginseside Rg31 3 5-三((3-基)苯基氨基]苯  97%仲丁 99.5%,無(wú)級(jí)

20S,24R-Epoxydammar-12,25-diol-3-one4,4',4''-*基三苯胺 98%仲丁  99%

20(R)-Ginseside Rh21,3,5-三(N,N-二苯基氨基)苯 97%仲丁 CP，99%

(20S)-Protopanaxatriol三苯胺 98%仲丁 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.9% (GC)

氫氧化鈣(>95%,BR)Phospho-Skp2 (Ser64) AntibodyPhospho-Rb(Thr826)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

低粘度羥基纖維素CDC20 (D6C2Q) Rabbit mAbPhospho-Rb(Ser795)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

L(+)二鈉二(>98%,BC )Sec61A1 (D4K2Z) Rabbit mAbPhospho-Rb(Ser788)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

亞硝酸(>96%,BR)Sec61A1 (D7Q6V) Rabbit mAbPhospho-Rb(Ser612)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

鹽酸吡哆胺(>98%,BC )MLLT1/ENL (D9M4B) Rabbit mAbphospho-Rb(Ser249)  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

楊酸鈉(>99%,USP)COBRA1 (D6K9A) Rabbit mAbPhospho-Rb (Thr821)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

3-(環(huán)己氨基 )-1-磺酸鈉(分子生物學(xué)級(jí))BCL6 (D4I2V) XP® Rabbit mAbPhospho-Rb (Ser807/Ser811)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

血紅素(>95%,BR)BCL6 (D4I2V) XP® Rabbit mAbPhospho-Rb (Ser608)  磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體

聚乙二800MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP® Rabbit mAbPhospho-RASGRF1(Ser929)  磷酸化Ras特異性鳥(niǎo)嘌呤核苷酸釋放因子1

炔雌;炔雌環(huán)戊MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP® Rabbit mAbPhospho-RasGRF1(Ser916)  磷酸化Ras特異性鳥(niǎo)嘌呤核苷酸釋放因子1
哈達(dá)爾沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格小鼠17羥孕(17-OHP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1克

小鼠25羥基維生素D3(25(OH)D3/25HVD3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1克

小鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1米

小鼠5羥色(5-HT)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

小鼠6前列腺素(6-K-PG)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：

小鼠6前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃，避光1克

小鼠8羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：10張/盒

小鼠8異前列腺素(8-iso-PG)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1公斤
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。