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注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
Lipids-Remover from proteins乙酸乙酯 GR,99.5%反二酸 99.5%

Oxyhemoglobin乙酸乙酯  for HPLC, >99.0%(GC)聚烯酸鈉 average Mw 500萬-700萬 ,80目

Prionex乙酸乙酯 ACS, ≥99.5%丁二酸 AR,99.5%

Ub乙酸乙酯 for HPLC, 99.9%丁二酸鈉 AR，99.0%

α-Lactalbumin乙酸乙酯 ACS 光譜級, ≥99.5%異辛  >99.0%(GC)

Rifampicin乙酸乙酯 分析標(biāo)準品，≥99.9% (GC)正壬 GCS, ≥99.5% (GC)

Erythromycin乙酸乙酯 用于蛋白測序分析, ≥99.5%正壬 98%

Bacitracin zinc乙酸乙酯 農(nóng)殘級L-腎上腺素 98%（）

Bacitracin乙酸乙酯 for LC-MS, ≥99.9% (GC)L-去甲腎上腺素 98%

Cytochalasin B乙酸乙酯 用于生物工程, ≥99.9%頭孢他定側(cè)鏈酸 98%

CTX鹽酸 AR,36-38%5-芐硫基四氮唑 98.5%

Cephalexin mohydrate過氧化氫溶液(30%) AR5-巰基-1-甲基四唑 98%

Cephalosporin C zinc salt GR,40.0%甲氧基胺鹽酸鹽 98%

CTC6-溴代己酸 97%疊氮鈉 AR,99%（）

Ciprofloxacin hydrochloride4-溴丁酸 98%四氮唑乙酸 98%

Ciprofloxacin4-溴丁酸乙酯 95%油酸 AR

月桂酸甲酯(Standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1131)/Insulin Receptor β (Tyr1146) AntibodyNitrotyrosine  硝基酪氨酸抗體

乙酰乙酸甲酯(Standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1131)/Insulin Receptor β (Tyr1146) AntibodyNIT2  NIT2蛋白抗體

甲基異丁酮(standard for GC, ≥99.5% (GC))Ezh2 (D2C9) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)NIT1  解酶1抗體

啉(Standard for GC,≥99.5%(GC))Nicastrin (D4F6N) Rabbit mAbNIS  鈉轉(zhuǎn)運體蛋白抗體

棕櫚酸甲酯(Standard for GC,≥98.0%(GC))Phospho-Insulin Receptor β (Tyr1361) (84B2) Rabbit mAbNIRF/RNF107  環(huán)指蛋白107抗體

酸甲酯(Standard for GC,≥99.7%(GC))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135/1136)/Insulin Receptor β (Tyr1150/1151) (19H7) Rabbit mAbNIR2  膜磷脂轉(zhuǎn)移蛋白1抗體

楊酸甲酯(standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135/1136)/Insulin Receptor β (Tyr1150/1151) (19H7) Rabbit mAbNIR1/RDGBA3  膜相關(guān)磷脂轉(zhuǎn)運蛋白抗體

油酸甲酯(Standard for GC,≥99%(GC))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135/1136)/Insulin Receptor β (Tyr1150/1151) (19H7) Rabbit mAbNIPP1/ARD1  核抑制蛋白磷酸酶1抗體

十一酸甲酯(Standard for GCS,≥99.0%(GC))Insulin Receptor β (4B8) Rabbit mAbNIPAL3  NIPA樣蛋白3抗體

己酸甲酯(Standard for GC,>99.5%(GC))Insulin Receptor β (4B8) Rabbit mAbNIPAL2  NIPAL2蛋白抗體
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