?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
Ammonium phosphomolybdate hydrate2,4-二氯-5-甲基嘧啶  98%N-乙酰-DL-甲硫氨酸 99%

APT2-羥基嘧啶鹽酸鹽 98%N-乙酰-L-谷氨酰胺 99%

Ammonium pentaborate2,4,6-* 95%S-芐基-L-半胱氨酸 98%

Ammonium benzoate阿拉伯樹(shù)膠 醫(yī)藥級(jí)L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽 98%

Ammonium citrate dibasic阿拉伯樹(shù)膠 顆粒狀，手選精致級(jí)，淡黃色L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽 98%

Ammonium ferril citrate brown棕櫚蠟 熔點(diǎn)：82.5℃,深黃色L-半胱氨酸 99%

Ammonium ferric oxalate棕櫚蠟 熔點(diǎn)：>83℃,淡黃色L-半胱氨酸 ≥98%,非動(dòng)物源，用于細(xì)胞培養(yǎng)

Ammonium formate還原鐵粉 AR，100目L-半胱氨酸鹽酸鹽，一 99%

Ammonium tartrate膽固 AR,>95.0%(GC)L-半胱氨酸鹽酸鹽無(wú)物 98%

TEBAC鄰氯苯甲 99%L-半胱氨酸鹽酸鹽 非動(dòng)物源,用于細(xì)胞培養(yǎng)，EP, USP

Ammonium alcohol polyvinyl phosphate氟苯 99%L-組氨酸鹽酸鹽，一 99%

Ammonium hexachloroplatinate(IV)4-氟甲苯 98%L-組氨酸 99%

Urea hydrogen peroxide二氧化錳 AR,85%L-組氨酸 EP, USP ，非動(dòng)物源,用于細(xì)胞培養(yǎng)

TED金屬錳片  99.9% metals basis,不規(guī)則片狀L-組氨酸 99.5%

TSC錳粉 99.99% metals basis,粉末L-賴氨酸鹽酸鹽 99%

Hydroxylamine solution錳粉 99.9% metals basis,粉末L-甲硫氨酸 99%

2,4-二硝基氯苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑：甲)IRAP AntibodyLaminin 2 alpha  層粘蛋白α2抗體

甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=6～4%,酮)FastScan™ Phospho-Vimentin (Ser56) ELISA KitLaminin 1+2  層粘連蛋白1+2抗體

矮壯素(標(biāo)準(zhǔn)品)Elase-1 Antibodylaminin  層粘連蛋白抗體

苯菌靈(標(biāo)準(zhǔn)品)Elase-1 AntibodyLamin B2  核纖層蛋白B2抗體

蕓苔素內(nèi)酯(標(biāo)準(zhǔn)品)PI3 Kinase Class III AntibodyLamin B Receptor  核纖層蛋白B受體抗體

因標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,基體:酮)LSP1 AntibodyLamin B [Nuclear Envelope Marker]  核纖層蛋白B抗體(細(xì)胞核內(nèi)參)

啶蟲脒(標(biāo)準(zhǔn)品)Plexin A1 Antibodylamin A/C  核纖層蛋白A抗體

多菌靈(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%)VISTA (D5L5T) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)lamin A/C  核纖層蛋白A/C抗體

(分析標(biāo)準(zhǔn)品,98%)Bak AntibodyLambda Light Chain  λ輕鏈抗體

鹽酸蘇堿(標(biāo)準(zhǔn)品)AsCpf1 (Strain <i>BV3L6</i>) AntibodyLAMA3/Laminin 5 alpha 3  層粘蛋白α3抗體
傳染性胸膜肺炎PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格生長(zhǎng)分化因子10抗體（TGF-β超家族10）Polypodine B 20,22-acetonide中文名：20,22-異丙叉基龍骨甾酮B別名：分子式：C30H48O8

G蛋白偶聯(lián)受體171抗體Desglucohellebrin中文名：別名：Deglucohellebrin分子式：C30H42O10

生長(zhǎng)激素抗體Polypodine B中文名：龍骨甾酮B別名：Polypodin B; 5-Hydroxyecdysterone分子式：C27H44O8

GDP甘露糖焦磷酸化酶抗體14β,16β-Dihydroxy-3β-(β-D-glucopyrasyloxy)-5α-bufa-20,22-dielide中文名：別名：分子式：C30H44O10

鳥苷酸激酶GMK抗體Withalide S中文名：醉茄內(nèi)酯S別名：分子式：C28H40O8